LEISHMANIOSE: MÉTODOS DIAGNÓSTICOS - Folha Médica 1998;117(2):131-134.

Christiane Cardoso Paes de Loureiro1
Paula Dadalti1
Maria Clara Galhardo Gutierrez2
Marcia Ramos-e-Silva 3

Trabalho realizado no Serviço de Dermatologia e no Curso de Pós-Graduação em Dermatologia, Faculdade de Medicina, HUCFF-UFRJ, Universidade Federal do Rio de Janeiro

1. Mestranda
2. Doutoranda
3. Professora Adjunto

Resumo: As autoras analisam os métodos laboratoriais clássicos, assim como os mais modernos, para o diagnóstico das formas cutânea, cutâneo mucosa e cutâneo difusa da leishmaniose, e discutem sua metodologia e indicação no curso evolutivo da doença.

O achado da leishmania no esfregaço, fragmentos de biópsia e/ou na cultura, e o teste de Montenegro permanecem os melhores parâmetros na decisão terapêutica, em especial em locais de infra-estrutura sanitária e laboratorial precária. Os métodos mais sensíveis e específicos para a detecção de formas amastigotas, entre eles a hibridização e o PCR, podem ser aplicados, em especial, nos casos de dúvida.

Os recentes avanços na biologia molecular vêm possibilitando o diagnóstico cada vez mais preciso no que diz respeito à identificação da espécie da Leishmania, cuja caraterização tem implicações epidemiológicas, prognósticas e terapêuticas; contudo os critérios clínico-epidemiológicos permanecem fundamentais para o diagnóstico desta dermatozoonose.

Abstract: The authors analyze the classical as well as the modern diagnostic procedures for cutaneous, mucous-cutaneous and difuse cutaneous forms of leishmaniasis and discuss their methodology and indication in the course of the disease.

The finding of leishmania in smears, biopsies fragments and/or in culture remains the better parameter for therapeutic decision, specially in areas with poor sanitary and laboratory condition. The more sensitive and specific techniques, as hybridization and PCR, may be applied, specially, in cases were there is doubt.

Recent advances in molecular biology permitted a more precise diagnosis related to the identification of the Leishmania species involved. The species characterization has epidemiological, prognostic and therapeutic implications, although the clinical and epidemiological criteria remains the most important for the diagnosis of this dermatozoonosis.


Introdução
A leishmaniose é uma doença infecciosa causada por diferentes espécies do protozoário dimórfico do gênero Leishmania. De acordo com a espécie do parasita e a resposta imune do hospedeiro observa-se evolução clínica para forma visceral (calazar), cutânea, cutâneo mucosa, cutâneo difusa ou dérmica pós calazar.1,2,3

O objetivo deste trabalho é analisar através de revisão da literatura os diferentes exames diagnósticos utilizados nas formas cutânea, cutâneo mucosa e cutâneo difusa da leishmaniose, discutindo sua metodologia e indicação no curso evolutivo desta doença endêmica em muitas áreas do Brasil.

Exame Direto
Os diferentes métodos diagnósticos utilizados para cada forma de leishmaniose (cutânea, visceral ou muco cutânea) variam muito, porém o achado principal em todos os casos continua sendo o isolamento ou a identificação do parasita em tecidos apropriados.4

O exame microscópico direto é a forma mais simples e rápida de fazer o diagnóstico de leishmaniose, embora não detecte parasita em todos os casos.5 O material pode ser obtido através de aspirado de lesões cutâneas, raspado das bordas das lesões ou esfregaços (imprints) das biópsias obtidas por punch ou bisturi. Os raspados são feitos após limpeza local com substância anti-séptica, a fim de diminuir a contaminação bacteriana, seguido da escarificação da borda da lesão com lâmina estéril, tentando-se evitar sangramento, e o material obtido é colocado sobre lâmina de vidro.

Os fragmentos de biópsia por sua vez devem ser suavemente pressionados sobre lâminas de vidro, tendo-se o cuidado para não comprimir o tecido. Tais lâminas devem ser submetidas à fixação com metanol e coloração pelo Giemsa, já que tal coloração é considerada a melhor no sentido de identificação do parasita. Os amastigotas de Leishmania são células pequenas, ovóides ou arredondadas, com membranas celulares finas, núcleos relativamente grandes e cinetoplastos em forma de bastões. São vistos no interior de histiócitos, assim como no extracelular. Os cinetoplastos coram-se em vermelho pelo Giemsa.

Dependendo do investigador e da técnica utilizada, os esfregaços têm positividade de 50% a 80%.6 Dados da literatura7 indicam que o esfregaço é um exame essencial no diagnóstico da leishmaniose, sendo inclusive usado rotineiramente por patologistas para outros espécimens que não pele como, por exemplo, linfonodos e tecido nervoso. Os esfregaços nem sempre são satisfatórios porque, em geral, há infecção secundária sobre as lesões, o que atrapalha a detecção dos organismos, além disso, os parasitas são encontrados muito profundamente nos tecidos.

Cultura para Leishmania
A capacidade de isolar Leishmania de aspirados de lesões cutâneas ou de espécimens obtidos por biópsia é dependente tanto da espécie do parasita quanto do meio de cultura utilizado. Os dois meios de cultura mais usados são o NNN (Novy-MacNeal-Nicolle) e o meio de Drosophila de Schneider suplementado por soro fetal de bezerro.4

Em 1996, Belkaid8 propôs um meio de cultura mais simples, constituído apenas por soro de coelho coagulado. O autor compartilha da opinião geral de que o meio NNN é simples e suficiente para o diagnóstico, porém considera sua composição, preparação e conservação complexos para zonas endêmicas de leishmaniose, onde haveria pouca infra-estrutura sanitária, sugerindo alternativa que atenderia a tais exigências.

O crescimento dos organismos da maioria das espécies costuma ocorrer em uma a duas semanas, mas as culturas devem ser mantidas e examinadas por quatro semanas. De uma forma geral, tanto esfregaço para exame direto quanto cultura devem ser feitos em casos suspeitos de leishmaniose, já que casos de esfregaços positivos podem ser cultura negativos e vice versa.9 No caso da doença mucosa, a cultura costuma ser mais sensível para o diagnóstico do que a microscopia direta. Cepas que não crescem em meio de cultura podem ser inoculadas em animais susceptíveis, mas este método não é prático para ser utilizado de rotina.

Exame Histopatológico
O fragmento cutâneo ou de mucosa obtido através de biópsia incisional ou por punch, fixado em formol a 10% é submetido à preparação histológica de rotina com coloração pela hematoxilina-eosina e examinado à microscopia óptica.

A histopatologia das lesões biopsiadas pode ser sugestiva, mas raramente é específica o suficiente para se poder fazer o diagnóstico sem a identificação da forma amastigota,4 que, conforme descrição anterior, caracteriza-se pela presença do cinetoplasto.

As alterações histopatológicas inespecíficas irão variar de acordo com a espécie de Leishmania e a resposta imunológica do hospedeiro. A epiderme pode apresentar hiperplasia pseudoepiteliomatosa ou, obviamente, descontinuidade no caso de lesões ulceradas. Na derme das lesões iniciais observa-se infiltrado composto por macrófagos parasitados, histiócitos, linfócitos, células gigantes e plasmócitos. A forma cutâneo mucosa caracteriza-se por lesões granulomatosas necrotizantes com escassez de parasitas, enquanto as formas difusas exibem riqueza de parasitas, grande quantidade de histiócitos, raros linfócitos e plasmócitos.

O exame histopatológico também pode ser útil para descartar outras doenças granulomatosas, infecções fúngicas ou outros diagnósticos. Tanto esfregaços corados pelo Giemsa quanto a cultura foram considerados mais sensíveis do que a histopatologia em alguns relatos.9

Teste de Montenegro
O teste intradérmico cutâneo ou teste de Montenegro pode ser altamente específico e sensível para o diagnóstico da leishmaniose cutânea e mucosa. É um método decisivo para o diagnóstico de lesões cutâneo-mucosas antigas, onde o número de parasitas é pequeno e, portanto, difíceis de serem detectados. O teste é também útil para seguimento em programas de vacinação e como parâmetro para avaliação e desenvolvimento de proteção imune.10

O teste de Montenegro na leishmaniose visceral aguda é sempre negativo, porém, em muitas áreas endêmicas de leishmaniose visceral, mais de 70% da população pode ter teste cutâneo positivo, o que implica em infecção prévia.11

Apesar do seu uso por muitos anos, é importante questionar alguns pontos, como a importância da composição do antígeno e a estabilidade da preparação do mesmo, pois ele é estocado por longos períodos e pode haver degradação protéica do mesmo.10

Na Etiópia, um estudo comparativo das sensibilidades dos métodos usados no diagnóstico da leishmaniose cutâneo-mucosa, em relação ao teste de Montenegro, mostrou que pacientes com teste cutâneo positivo para um tipo de antígeno poderia ser negativo para outro tipo de antígeno.11

No Brasil, num estudo comparativo em pacientes com leishmaniose cutânea comprovada, usando tanto espécies múltiplas de antígenos (L. mexicana, L. amazonensis e L. guyanensis) como espécie única de antígeno (L. amazonensis), verificou-se que não houve diferença significativa nos resultados, no que se refere à positividade do exame. A degradação protéica do antígeno foi evidente em ambos os grupos testados. Este trabalho indica que os elementos responsáveis pela atividade do antígeno estariam presentes em diferentes espécies de Leishmania, não havendo necessidade de se trabalhar com extratos complexos de mais de uma espécie. Além disso, a manutenção de extratos antigênicos biologicamente ativos por longo período, apesar da intensa atividade proteolítica, sugere a possibilidade de que elementos responsáveis pela atividade antigênica não sejam proteínas, ou, se forem, agiriam como unidades peptídicas pequenas.10

Já em um estudo americano realizado no Brasil, comparando a eficácia de antígenos do Novo Mundo (L. braziliensis guyanensis, L. mexicana amazonensis e L. mexicana) e antígenos do Velho Mundo (L. major), observou-se que as preparações antigênicos do Novo Mundo mostraram-se mais eficazes do que as outras na detecção da doença.12

Desse modo, apesar dos grandes avanços da biologia molecular e da necessidade de padronização dos antígenos,13 a preparação de antígenos definidos a nível molecular e padronizados para testes cutâneos ainda não é possível.

Sorologia
Testes sorológicos são de utilidade clínica limitada para o diagnóstico da leishmaniose cutâneo-mucosa, forma onde a sensibilidade e especificidade são baixas. Ao contrário, esses mesmos testes são altamente sensíveis para o diagnóstico da leishmaniose visceral. O problema relacionado ao seu uso no diagnóstico da leishmaniose visceral consiste na especificidade, pois há falso positivos em infecções assintomáticas por Leishmania ou em outras doenças infecciosas.

Os métodos de detecção de anticorpos mais usados são o ELISA e o teste de aglutinação direta. O ELISA é o mais específico e sensível dos testes, porém é bastante caro. o teste de aglutinação direta requer poucos reagentes, mas precisa de um longo período de incubação e, na maioria das vezes, não é tão específico quanto o ELISA.4

Em um estudo realizado no Ceará, utilizou-se o teste de aglutinação direta inclusive para determinar infecção por Leishmania em cães, indicando a possibilidade deste teste também servir para levantamento epidemiológico da infecção em reservatórios.14

A alteração dos antígenos usados para o teste de aglutinação direta e para o ELISA tem se mostrado eficiente na eliminação de falso positivos. O antígeno recombinante para ELISA, antígeno r39, é de particular interesse, pois detecta 95 a 100% dos casos de leishmaniose visceral clássico e não identifica outras infecções não leishmanióticas , a não ser alguns casos de toxoplasmose.9 Níveis de anticorpos significativamente elevados foram encontrados em pacientes com mais de oito semanas de evolução da doença, quando comparados a pacientes com curso clínico menor,15 por outro lado os títulos de imunoglobulinas detectados por ELISA diminuem após o início do tratamento, ajudando no reconhecimento da falência medicamentosa.9

Estudos sorológicos de rotina são positivos em cerca de 50% dos pacientes HIV-positivos; contudo, a imunodeficiência observada nesses pacientes resulta numa probabilidade aumentada de que os monócitos do sangue periférico estejam parasitados por Leishmania.9

Técnicas mais recentes
O diagnóstico da Leishmaniose é muitas vezes difícil devido à escassez de parasitas que geralmente estão presentes nas amostras clínicas e à baixa sensibilidade das técnicas tradicionais. Atualmente com o conhecimento do genoma das Leishmanias, importantes avanços no diagnóstico desta parasitose têm ocorrido. Utilizando a técnica de hibridização ou a reação da polimerase em cadeia (PCR), tornou-se possível a detecção e identificação das formas amastigotas, dispensando deste modo a cultura e análise isoenzimática da cepa. Esses métodos aumentaram de forma importante a sensibilidade no diagnóstico da leishmaniose, além de serem métodos muito mais rápidos e exigirem somente uma pequena amostra do material a ser estudado.16,17

A técnica de hibridização, utilizando anticorpos monoclonais em tecidos, têm permitido uma sensibilidade de até 90%;9,18,19 assim como o PCR, com sondas genômicas específicas, também tem revelado uma sensibilidade alta.5,16,17,20

Entretanto, existem problemas inerentes às técnicas. Ambas necessitam de pessoas treinadas para a sua execução. No caso da hibridização, a estrutura da Leishmania não é tão aparente como o é na coloração pelo Giemsa, e se deve estar atento para a presença de debris do hospedeiro, que podem se confundir com a amastigota.9 Já no PCR, a presença de contaminação cruzada entre as amostras ou a presença de um produto não específico amplificado de tamanho similar ao produto esperado, podem levar a resultados falsos-positivos.5

Conclusão
Até o presente, a leishmaniose cutânea, mucosa e visceral deve ser diagnosticada por métodos parasitológicos clássicos: exame de esfregaços de tecido corados pelo Giemsa e cultura de tecido. Quando o diagnóstico da doença cutânea e mucosa parece duvidoso, o teste de Montenegro provou ter boa sensibilidade relacionada à região de exposição, podendo ser útil na decisão terapêutica. Quando o diagnóstico da forma visceral parece duvidoso, o teste sorológico pode ser aplicado como fator de decisão terapêutica.

O desenvolvimento de métodos sensíveis e específicos para detecção de formas amastigotas de Leishmania continua sendo objeto de estudo de múltiplos investigadores em todo o mundo.

A caracterização da espécie da Leishmania tem implicações não só epidemiológicas como também de prognóstico e terapêutica, daí sua importância. Os recentes avanços em biologia molecular vêm possibilitando um diagnóstico cada vez mais preciso no que diz respeito à identificação da espécie da Leishmania, contudo os critérios clínico-epidemiológicos permanecem fundamentais para o diagnóstico desta dermatozoonose.

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